【儲存與運輸】

冰袋運輸；蛋白標準品 (BSA) 4℃保存，有效期 12 個月。配制成的蛋白標準溶液后需 -20℃ 保存，并在 6 個月內使用。其余試劑常溫保存，有效期 12 個月。

【使用方法】

1. 配制蛋白標準貯備液：取 1 mL 蛋白標準配制液加入到蛋白標準品 (BSA) 蛋白標準管

中，將 25 mg 蛋白標準品完全溶解，即得到濃度為 25 mg/mL 的蛋白標準貯備液。配制成的蛋 白標準溶液可-20℃ 長期保存。

2. 配制蛋白標準工作液：取適量 25 mg/mL 蛋白標準貯備液，用 PBS 或生理鹽水稀釋 50

倍，得到終濃度為 0.5 mg/mL 的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照 10 倍梯度方法稀釋，確保 稀釋準確。

3. 繪制標準曲線 (酶標儀法) ：將蛋白標準工作液分別按 0，1，2，4，8，12，16，20 μ L 加到 96 孔 板中，然后用 PBS 或生理鹽水依次加 20，19，18，16，12，8，4，0 μL 將上 述梯度工作液補足到 20 μL。得到蛋白濃度依次為 0，25，50，100，200，300，400，500 μ g/mL 的梯度曲線。

4. 準備待測樣品：將待測的蛋白樣品進行適當稀釋 (可通過預實驗檢測，使樣品蛋白濃度 在標準曲線范 圍內，確保檢測結果可信) ，按照每個樣品 20 μL 的量加到 96 孔板中。待測 樣品與蛋白標準品用相 同溶液稀釋。

5. 配制 BCA 顯色工作液：將 BCA 試劑與硫酸銅溶液按照 50:1 體積比充分混合均勻， 得到 BCA 顯色工作液。BCA 顯色工作液可室溫保存，24 h 內使用。每個待測樣品需 200 μL ，建議按需配制，避免浪費。

6. 檢測：向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入 BCA 顯色工作液 200 μL，充分混 勻 (可將 96 孔板放在振蕩器上振蕩 30 s) ，37℃反應 30 min 后，以標準曲線 0 號做參比 ，在 562 nm 波長下比色測定，  記錄各孔吸光度值。  (注：也可以在室溫反應 2 h，或 60℃ 反應 30 min。如果蛋白濃度較低，建議置 于 60℃反應)

7. 計算：以標準曲線中梯度蛋白含量 ( μg/mL) 為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準 曲線。根據(jù)所測 樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應孔中待測樣品的蛋白濃度 ( μg/mL ) ，再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實際蛋白濃度。議按需配制，避免浪費。

【注意事項】

1.BCA 法測定蛋使用 BCA 蛋白測定法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，并且顯色 反應的速度和溫度有關，因此需注意保持定時和定溫，以確保精確定量，若顯色反應時間和溫 度無法精確控制，宜每次都做標準曲線。

2.在進行蛋白標準貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時建議 10 倍梯度稀釋，  不要一次稀釋 50 倍，以免產(chǎn)生較大誤差。

3.低溫或長期保存，若發(fā)現(xiàn) BCA 試劑 A 或者試劑 B 有沉淀發(fā)生。請 37oC 溫育并伴隨攪 拌促使其充分溶解。如發(fā)現(xiàn)細菌污染，則應舍棄，避免對實驗結果造成影響。

4. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。